鬼臼类植物是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亚科(Podophylloideae)桃儿七属(Sinopodophyllum)、山荷叶属(Diphylleia)、八角莲属(Dysosma)及足叶草属(Podophyllum)植物的统称。鬼臼类植物是一类含有显著生物活性物质,又有悠久应用历史的药用植物,用于治疗多种疾症。1880年,Podwyssotzkii从美洲桃儿七(Podophyllum peltatum)的树脂中分出了结晶性成分鬼臼毒素(podophyllotoxin),后来证明鬼臼毒素具有显著的抗癌活性;其衍生物鬼臼乙叉苷(VP16)、鬼臼噻吩苷(VM26)等已被美国FDA批准上市,用于治疗多种癌症。目前鬼臼毒素主要从鬼臼类植物根、茎中提取,过度采挖致使植物资源遭到严重破坏;44学合成鬼臼毒素的难度大,成本高,全合成不经济;植物组培虽取得了一定进展,但还无法实现大规模工业化生产。1993年,Strobel等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分到一株产紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉(Tax-omyces andreanae),因而开始了利用植物内生真菌发酵生产抗癌活性成分新途径的研究。为此,我们开展了对桃儿七、南方山荷叶、川八角莲等植物内生真菌的研究,现报道其中部分工作结果。
1 材料和方法
1.1 材料
桃儿七(Sinopoclophyllum hexandrum)、南方山荷叶(Diphylleia sinensis)采自云南省中甸县,川八角莲(Dysosma z~itchii)采自云南省蒿明县。鬼臼毒素标准品购自Sigma公司。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖培养基(m A)、查氏培养基、促孢培养基、改良基础液体培养基(MM)。
1.3 内生真菌的分离和纯化
植物样品采集后立即处理。取三种植物地下茎,按下列程序表面消毒:自来水冲洗干净—町5%酒精漂洗(3~5min)一无菌水冲洗3~4次。1%升汞漂洗(10~30s)一无菌水冲洗5次。将上述处理过的茎在无菌条件下切割成约0.5crn×0.5 era的小片(取韧皮部),然后将小片种植于PDA平皿上,置于
为检查表面消毒是否彻底,做了对照实验。将上述同样条件处理过的茎段不作切割直接种植于PDA平皿上,置于相同条件下培养,结果对照用的茎段周围无任何菌长出,多次重复如此,证明所分到的菌是韧皮部内的,而不是表面的附生菌。
1.4 产鬼臼毒素菌株的筛选
2 结果与分析
2.1 内生真菌的分离
从上述三种植物中共分得内生真菌92株,其中从桃儿七分得内生真菌28株,占总分离菌株数的3096;南方山荷叶内生真菌35株,占总分离菌株数的38%;川八角莲内生真菌29株,占总分离菌株数的3296。仅从三种植物地下茎韧皮部就分离出92株内生真菌,充分显示出植物内生真菌资源的丰富。丛梗孢属、青霉属为三种植物内生真菌共有的优势属,而无孢菌群、曲霉属、毛壳菌属、拟青霉属为三种植物内生真菌常见属,其余为偶见。这说明三种植物内生真菌有一定共性,但植物种类不同,生境不同,内生真菌也存在着较大差异。
2.2 产鬼日毒素菌株的筛选
经TLC初步分析表明,在92株内生真菌中,共有8株菌的液体发酵提取物出现了与标准品迁移率(Rf)相同的斑点,它们可能产鬼臼毒素。为了证实它们是否确能产鬼臼毒素,采用HPLC对它们的发酵提取物进行了分析检测,结果表明,其中2株不产鬼臼毒素,其余6株能产鬼臼毒素,占总分离菌株数的6.596,其中桃儿七产鬼臼毒素内生真菌2株,占分离自该植物内生真菌总数的7%;南方山荷叶产鬼臼毒素内生真菌1株,占分离自该植物内生真菌总数的3% ;川八角莲产鬼臼毒素内生真菌3株,占分离自该植物内生真菌总数的10%。这也表明植物内生真菌中存在着丰富的产抗癌活性成分的真菌资源。
2.3 产鬼臼毒素菌株属的分布
从三种植物分离的产鬼臼毒素内生真菌分布在青霉属(Penicillium)等4个属中。其中青霉属为三种植物产鬼臼毒素内生真菌的共有属,但种不同。从桃儿七分离的是点青霉(P.notaztum),从南方山荷叶分离的是纠错青霉(P.implicatum),从川八.角莲分离的是产紫青霉(P.purpurogenum o这说明,产鬼臼毒素内生真菌资源具有丰富的多样性。
3 讨论
植物内生真菌,是指生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内的一类真菌,被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症,可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。这类菌涵盖面相当广,包括菌根真菌和植物病原真菌在内。也有一些研究者认为内生真菌是指存在于健康植物茎叶中,形成不明显侵染的一类真菌。植物内生真菌在植物微生态系统中,长期与宿主建立了和谐的协同关系,其次生代谢产物十分丰富,具有多种生物活性n
通过研究,我们发现植物内生真菌资源十分丰富。植物种属不同,生境不同,内生真菌存在较大差异。某些植物内生真菌能产生与宿主植物相同或相似的抗癌活性成分是抗癌药物研究和开发的重要资源。同时,植物内生真菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的深远意义,又有多方面的应用潜力,是人类亟待保护和开发利用的宝贵资源。在植物内生真菌研究中,还应重视以下问题:
(1)采样季节不同,同一地点同一植株的同一部位分到的内生真菌也存在一定差别,这可能是由于植物内生菌有的能长久存在于植物组织内,有的则只在整个生活史中存在一段时间所致。
(2)采用的研究方法和手段不同,也会造成对植物内生真菌分离准确性的影响。目前对植物内生真菌种类数量的估计依赖于培养基,用哪些培养基才能反映内生真菌在宿主组织中的真实种群及数量,尚需探讨。另外,在自然条件下,微生物本来是混居的,并非单独存在。不少微生物至今难以人工培养、检测,许多微生物只有混合培养时才能生长,而在纯培养时就不能生长。因此,内生真菌的分析研究有待深人,在方法手段上也有待改进。
(3)植物内生真菌的遗传稳定性是值得深人探讨的问题。所分离到的菌株,在1~3代时可保持产宿主某些活性成分(抗癌物质等)的特性,而多次转接后往往减弱,甚至消失这种特性,其中原因待查,尤其涉及到与宿主的协同进化关系和生态条件等。